DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書
DNAFect Transfection Reagent
目錄號：YJ0860
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組分說明
Catalogno. YJ0860 YJ0860A
KitSize 0.5 ml 1 ml
DNAFect Transfection Reagent 0.5 ml 1 ml
產(chǎn)品簡介
DNAFect是一種的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于多種細胞的DNA轉(zhuǎn)染。對于大多數(shù)細胞系包括原代細胞都有較高的轉(zhuǎn)染效率，并且對細胞毒性極低。本轉(zhuǎn)染試劑可應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染、高通量DNA轉(zhuǎn)染，基因表達和基因功能研究。
注意事項
1.轉(zhuǎn)染試劑使用前應(yīng)先震蕩搖勻。
2.轉(zhuǎn)染效率與細胞密度有很大關(guān)系，不同實驗間應(yīng)保持一個基本的傳代步驟，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。
一般貼壁細胞轉(zhuǎn)染的*細胞密度是80-90%，懸浮細胞的*細胞密度為3-5×10 5細胞/ml，用于轉(zhuǎn)染的*細胞密度
3. 轉(zhuǎn)應(yīng)染根據(jù)不同的時不要在培細養(yǎng)胞基中加入抗生素，否類型或用途而異。則會導(dǎo)致細胞死亡。
操作步驟
對于大部分的細胞系， DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時轉(zhuǎn)染效率較高。為了提高轉(zhuǎn)化效率、表達水平并且減少細胞毒性，實驗應(yīng)在細胞密度較大時進行轉(zhuǎn)染。以下操作以24孔板每孔細胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例。
1. 貼壁細胞：轉(zhuǎn)化前一天，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養(yǎng)基，并于每孔中接種0.5-2×105 個細懸浮細胞：在胞，待細胞轉(zhuǎn)細染之前，在胞長至80-90%24孔板的滿時進每行孔中加入轉(zhuǎn)染。500μl無抗生素的生長培養(yǎng)基，并于每孔中接種3-5×10 5個細胞。
2. 轉(zhuǎn)染當天，首先準備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，對于每孔細胞按照以下用量配制：
a. 取適量DNA，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，并輕輕的混合均勻。
b. 取適量DNAfect，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，并于室溫孵育5分鐘。
c. 孵育5分鐘之后，將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合（使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl），輕輕混合均勻，并在室溫下孵育20分鐘（溶液可能會出現(xiàn)絮狀，但不會影響轉(zhuǎn)染效率）
注意：該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時。
3. 將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細胞生長培養(yǎng)基更換成450 μl無血清培養(yǎng)基，然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24細胞孔板內(nèi)，輕輕前后推動24孔板以混勻。
4. 將細胞置于含5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)4-6小時后，更換成500 μl生長培養(yǎng)基。
5. 18-48小時后進行轉(zhuǎn)染基因表達的檢測。
6. 對于穩(wěn)定的細胞系：在轉(zhuǎn)染24小時后，細胞按照1:10的比例傳代，第二天可加入篩選培養(yǎng)基進行篩選。
注：(1) 該說明為一個24孔的用量，若同時轉(zhuǎn)幾個孔，配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍；若轉(zhuǎn)染其他類型孔板，DNA和DNAfect用量見附表，
該附表用量以293T細胞為轉(zhuǎn)染細胞時的標準用量。
(2) 轉(zhuǎn)染4-6小時后也可以不更換生長培養(yǎng)基，但由于DNAfect具有一定的細胞毒性，作用時間過長可能使某些細胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，建議更換生長培養(yǎng)基。
(3) 優(yōu)化條件：想要得到更高的轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件：培養(yǎng)物、DNA濃度、細胞數(shù)和細胞與DNA復(fù)合物的孵育時間等條件都應(yīng)進行優(yōu)化。
