牛傳染性胸膜肺炎檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：牛傳染性胸膜肺炎檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒利用改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測(cè)。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)牛傳染性胸膜肺炎基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號(hào) | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | 牛傳染性胸膜肺炎 PCR反應(yīng)液 | 437.5μL×1管 | 875μL×1管 |
2 | 牛傳染性胸膜肺炎 混合酶液 | 62.5μL×1管 | 125μL×1管 |
3 | 牛傳染性胸膜肺炎 陽(yáng)性對(duì)照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 牛傳染性胸膜肺炎 陰性對(duì)照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | DNA提取液 | 1.5 mL×1管 | 1.5 mL×2管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對(duì)照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽(yáng)性對(duì)照為牛傳染性胸膜肺炎經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 動(dòng)物組織樣本采集后取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心后取上懸液備用，避免標(biāo)本間交叉污染。
2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃，長(zhǎng)期保存不會(huì)影響本試劑盒檢測(cè)結(jié)果，但有可能影響培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作：
a.取試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。
b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。
c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。
d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測(cè)。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集牛傳染性胸膜肺炎 熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【陽(yáng)性判斷值或者參考區(qū)間】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測(cè)結(jié)果 | 標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出牛傳染性胸膜肺炎 |
陽(yáng)性（＋） | 標(biāo)本中檢測(cè)出牛傳染性胸膜肺炎 |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
- 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的低檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
- 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用，對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項(xiàng)】
- 整個(gè)檢測(cè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
- 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。
- 為保證試劑不受標(biāo)本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。
- 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。
- 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在di一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。
- 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
- 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。
- ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
- 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。
